Molekularna karakterizacija Pseudomonas syringae pv. morsprunorum poreklom sa trešnje i šljive u Srbiji

Abstract

Bakterija Pseudomonas syringae pv. morsprunorum, prouzrokovač bakteriozne pegavosti listova i plodova, ekonomski je značajan patogen koštičavih vrsta voćaka. Pri povoljim vremenskim uslovima za razvoj (kišovito i prohladno vreme) bolest se brzo širi zahvatajući masovno listove cele krune stabla. Pored pegavosti, P. s. pv. morsprunorum prouzrokuje simptome uvelosti, sušenja i rak rane drvenastih delova biljnih domaćina. Cilj ovog rada je da se genetički okarakterišu sojevi P. syringae pv. morsprunorum poreklom sa obolelih listova trešnje i šljive. U radu su korišćeni sojevi poreklom sa trešnje (lokalitet Topola, 2016. godina) i šljive (lokalitet Krušedol selo, 2020. godina). Genetička karakterizacija je vršena metodom analize multilokusnih sekvenci (MLSA), dobijenih korišćenjem 4 konzervisana gena: gapA, gltA, gyrB i rpoD. DNK sojeva je izolovana CTAB metodom, a amplifikacija je vršena metodom lančane reakcije polimeraze (PCR) prema sledećem programu: početna denaturacija na 94 °C u trajanju od 3 minuta, zatim 30 ciklusa denaturacije na 94 °C 2 minuta, hibridizacije na 54 °C (gapA), 56 °C (gltA), 62 °C (gyrB) ili 63 °C (rpoD) 1 minut i elongacije na 72 °C 1 minut, i finalna elongacija na 72 °C u trajanju od 10 minuta. PCR produkti su sekvencirani i dobijene sekvence su korišćene za konstruisanje filogenetskih stabala (MegaX program) na osnovu pojedinačnih i konkatamernih sekvenci. Za filogenetsku analizu su pored sojeva poreklom sa trešnje i šljive iz Srbije korišćeni i referentni sojevi vrsta prouzrokovača bakteriozne pegavosti koštičavog voća deponovani u NCBI bazi (P. s. pv. morsprunorum rase 1 i 2, P. s. pv. syringae, P. s. pv. avii, P. s. pv. persicae i P. cerasi). PCR amplifikacija je rezultirala produktima veličine 634 bp (gapA), 556 bp (gltA), 610 bp (gyrB) i 521 bp (rpoD) kod svih analiziranih sojeva. Sekvence su sređene i poravnate na veličine od 610 nt (gapA), 526 nt (gltA), 569 nt (gyrB) i 483 nt (rpoD). Na osnovu pojedinačnih gena sojevi sa trešnje i šljive iz Srbije su grupisani u jedan klaster na filogenetskom stablu, što ukazuje na njihovu genetičku homogenost. Zbirno filogenetsko stablo konstruisano na osnovu konkatamernih sekvenci sva četiri gena (2188 nt) grupisalo je sojeve sa trešnje i šljive zajedno sa P. s. pv. morsprunorum rasom 1 poreklom sa šljive iz Poljske i P. amygdali pv. morsprunorum poreklom sa trešnje iz Velike Britanije i Srbije izolovanim 2012. godine. Referentni sojevi ostalih Pseudomonas vrsta korišćenih za filogenetsku analizu jasno su odvojeni u posebne klastere. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da su sojevi P. s. pv. morsprunorum rasa 1 poreklom iz Srbije genetički homogeni bez obzira na godinu, domaćina ili lokalitet sa kog su izolovani.