Utvrđivanje genetičke strukture populacija Acidovorax citrulli u Srbiji

Abstract

Bakteriozna mrljavost plodova lubenice (Acidovorax citrulli) predstavlja širom sveta ozbiljnu pretnju uključujući uzgajivače i proizvođače semena i rasada gajenih vrsta biljaka iz porodice Cucurbitacae. Krajem 1980-ih, bakterija A. citrulli se nakon epidemijskih pojava na lubenici u SAD proširila na druga područja i useve (dinja, tikva, bundeva, krastavac). Do danas su opisane dve genetički različite populacije A. citrulli. U Srbiji je prvi nalaz A. citrulli zabeležen 2014. godine na lubenici u lokalitetima Bačke i Srema. Međutim, uprkos sprovedenim eradikativnim merama i naporima u upravljanju ovim patogenom, ponovo je detektovan 2018., 2021., i 2022. godine na području Mačve i Srema. U cilju boljeg razumevanja genetičke strukture populacija A. citrulli prisutnih u Srbiji, u ovom radu je korišćena analiza sekvenci više genskih lokusa (MLSA) primenom konzerviranih gena i gena virulentnosti. Tokom rada korišćena su četiri reprezentativna soja A. citrulli, pod šiframa Ac414 (Čelarevo, 2014), Ac818 (Šabac, 2018), Ac221 (Ašanja, 2021) i Ac322 (Hrtkovci, 2022), odabrana na osnovu prethodnih rezultata dobijenih umnožavanjem ponavljajućih sekvenci DNK (rep-PCR). Za MLSA je korišćeno devet gena, i to osam konzervativnih (gltA, gmc, gyrB, lepA, phaC, pilT, trpB, ugpB) i jedan gen virulentnosti (Aave_1548). PCR program se sastojao od inicijalne denaturacije (5 min na 95 °C), praćene sa 30 ciklusa denaturacije (30 s na 95 °C), 11 hibridizacije (30 s na 60 °C za konzervativne gene i 55 °C za gen virulentnosti Aave_1548) i elongacije (30 s za konzervativne gene i 90 s za gen Aave_1548 na 72 °C); i finalne elongacije (5 min na 72 °C). Amplifikovani produkti su sekvencirani u Eurofins Genomics (Hamburg, Nemačka). Kvalitet dobijenih sekvenci je manuelno pregledan, nakon čega je za svaki od četiri testirana soja napravljena multigenska sekvenca na osnovu svih sekvenciranih gena. mMultigenske sekvence testiranih i referentnih sojeva A. citrulli preuzetih iz baze podataka Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) korišćene su za konstruisanje „Neighbor-joining” filogenetskog stabla. Na osnovu rezultata filogenetske analize, dokazano je da sojevi A. citrulli izolovani iz prirodno zaraženih plodova lubenice u Srbiji (2014-2022) pripadaju dvema reprezentativnim genetičkim grupama opisanim u svetu (grupe I i II). Grupi I su pripadali sojevi izolovani 2021. i 2022. godine, a grupi II sojevi izolovani 2014. i 2018. godine. Rezultati dobijeni u ovom radu ukazuju na puteve introdukcije i širenja A. citrulli u Srbiji.